技术共探丨关于USP对照品，你了解多少？
2022/06/07
技术共探丨点击探清生物制品无菌检查方案（上）
2022年03月15日
根据中国药典的要求，凡直接进入人体血液循环系统、植入或埋入肌肉、皮下组织、与创伤部位接触的产品、材料或器械，以及医学使用上要求无菌的品种都应当进行无菌检查。为确保产品无菌检查方法的准确性，在进行产品无菌检查时，应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的无菌检查。
无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
1. 无菌检查法的概念与基本要求
药品无菌标准是国家对药品生产的卫生法规。它对药品生产企业、药物研发机构的文明生产、现代化管理及保证药品的卫生质量，保证人民的健康起着重要的促进作用。无菌检查法目的在于保证无菌检查的药品安全。因此凡用于确定要求无菌的药品、原料、辅料及要求无菌的其他品种在出厂前均应进行无菌检查，它是保证药物制剂质量的重要措施。[1]
《中国药典》从1953年版开始就收载该项检验内容，并且方法学不断完善。它在保证人民用药安全方面有着十分重要的意义。据统计，《中国药典》（2005年版）共有238个单列品种规定要进行无菌检查。所以无菌检查是药品卫生学检验最早的项目和各国药典最早收载的检验内容，上世纪初就列入要求项目。[2]
2. 国内外相关技术方法对比
国际上《美国药典》、《欧洲药典》无菌检查法已通过ICH完成协调，《中国药典》2020年版无菌检查法与他国药典的各项主要参数也基本一致，尚存的主要差异是在整合过程中基本求同存异的考虑，具体差异点见表1。鉴于欧美药典与中国药典的差异，产品在进行中美双报时需要分别开展方法适用性试验及检测。[3]
表1 无菌检查法-药典传统方法差距分析
3. 现阶段都有哪些检测方法
目前对于无菌检查的实验方法包括：
01 直接接种法
即取规定量供试品接种硫乙醇酸盐流体培养基（FTM）和胰酪大豆胨液体培养基（TSB）中。生物制品无菌检查时硫乙醇酸盐流体培养基（FTM）和胰酪大豆胨液体培养基（TSB）接种的瓶或支数为2：1。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种供试品体积不得大于培养基体积的10%，供试品检查时，培养基的用量和高度同方法适用性试验。[1]
02 薄膜过滤法
无菌检查使用薄膜过滤法时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前应先将少量的冲洗液过滤，以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。冲洗过程中可适度振摇，以避免滤器侧壁的样品残留。其他步骤应与方法适用性检查相同。[1]
03 无菌快速检验方法
无菌检查快速检测法包含两种，一种为基于生长代谢的检测方法，该检测方法中又分为ATP 生物发光检测技术、CO2检测技术、电阻抗检测技术；
另一种是基于细胞的检测方法，该检测方法中分为荧光染色技术和流式细胞技术。具体如下：[3]
基于生长代谢的检测方法
ATP 生物发光检测技术
样品经过薄膜过率器过滤后，在营养丰富的平板上培养。培养过程中微生物细胞产生ATP，荧光素酶催化ATP依赖的荧光素氧化脱羧反应发光。当所有反应成分都过量时，产生的光信号与ATP的释放量成比例。因此ATP生物发光能有效地指示微生物是否存活。该技术可以将无菌检查的培养时间缩短至5天。
CO2检测技术
大多数微生物在生长过代谢过程中会产生CO2，通过在培养体系中加入能与CO2结合发光或产生颜色变化的物质，检测培养物中荧光强度或检测颜色变化，可以在较短的时间内获取微生物的生长繁殖信息，从而判断培养体系中是否存在活的微生物。
电阻抗检测技术
微生物的生长将带弱电的大分子 （如多聚糖）代谢为带强电的代谢小分子产物（如有机酸等）。随着微生物的不断繁殖，带电的产物不断富集，直至最终到达检测器的检查阈值。
基于细胞的检测方法
荧光染色技术
采用薄膜过滤法将微生物截留于膜表面，用活体底物标记捕获的细菌，在具有代谢活性的微生物细胞质中，非荧光的底物被水解酯酶切断，释放出荧光发光物质。仅有细胞壁完整的活体微生物有能力在检测中保留标记物。通过激光检测器自动扫描检测具有荧光标记的细胞及其数量。该方法无需细胞繁殖，灵敏度达1个细胞水平，2～3小时即可得到检测结果。
流式细胞计数
与荧光染色技术相似，微生物在溶液中被荧光的标记物标记并产生荧光底物。体系中的颗粒物依次通过流式细胞仪的激光检测器，并捕获荧光信号。该方法适合于检测液体中的微生物。
【参考文献】
[1] 《中国药典》2020版 三部和四部1101无菌检查法
[2] 《中国药典》（2005年版）三部和四部1101无菌检查法
[3] 中国药典分析检测技术指南—国家药典委员会编著2017.07出版(1)
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