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2022/06/07
技术共探丨召唤「原神」之力！关于衍生化你知道这5点吗？
2022年05月20日
如同显微镜打开了人类研究微观世界的大门，液相色谱质谱联用技术的出现，使得研究者们可以更加科学精确地识别和分析各类复杂样品基质中的化合物。而要完成这项研究，衍生化往往是绕不开的重要一步。
对于一些原生形态对质谱检测灵敏度较低的化合物来说，化学衍生化是提高灵敏度的常用方法。本期#技术共探，我们将共同探讨衍生化在生物分析液相色谱质谱联用技术中的具体应用。
衍生化，召唤「原神」之力！
在生物分析研究中，面对复杂样品基质中的未知化合物无从下手？衍生化往往能化繁为简，直抵破题关键，召唤出物质的「原神」。
衍生化是一种利用化学变换把化合物转化成类似化学结构物质的方法，一般是化合物的某个特定原子或者特定基团被取代成衍生化物的特定基团，由此产生的新的化学性质可用于量化或分离。
对于ESI来说，衍生化的目的是在待测物的结构中引入一个易于离子化的基团；对于APCI来说，衍生化则是在待测物的结构中引入一个具有很高的质子亲和力或者电子亲和力的基团。此外，化学衍生化还能够改变待测物的色谱保留时间，减少生物样品中和待测物一起洗脱的内源性物质产生的离子抑制。
LC-MS/MS分析中衍生化的分类
• 羟基化合物
当前各类文献中，有关生物样品分析方法的研究，衍生化大多数是用来分析甾体类化合物的，因为甾体类化合物普遍在质谱的响应效果往往不佳所以需要衍生化手段的辅助。甾体类化合物都具有醇羟基，酚羟基或者酮基。其中醇羟基的衍生化应用已经涵盖了API离子化的各种模式，并且是离子化活性基团引入的主要位点。
Gao S等多位专家[1]的研究表明，他们使用苯甲酰氯衍生化丙二醇，并且建立了定量分析大鼠血浆和肺中的丙二醇的分析方法，检测限分别为0.27 μg·mL-1和1.1 μg·g-1。分析认为，通过在结构中引入苯甲酰基，气态条件下丙二醇的碱性和质子转移能力都得到了明显提高。
Shou W Z等专家则报道了通过丹酰化试剂衍生化测定人血浆中乙炔雌二醇的LC/MS/MS方法，采用1mL血浆，定量限为2.5 pg·mL-1[2]。
• 酮类和醛类化合物
酮类和醛类化合物较易通过衍生化反应来提高离子化效率，进而提高检测的灵敏度。
2，4-二硝基苯肼（DNPH）通常是用来增加紫外吸收的衍生化试剂，也可以用来与含有醛基的化合物反应以提高其质谱响应。例如在人血浆的鱼腥草分析中，就采用衍生化反应顺利地分析了人血浆中鱼腥草的含量[3]，定量限仅为1.0 ng·mL-1。
• 巯基化合物
因为在生物样品采集过程中，巯基往往非常不稳定，关于巯基的衍生化都是生成半胱氨酸类似物。硫普罗宁的巯基衍生化反应就是与丙烯酸发生麦氏加成反应。这一反应既稳定了巯基又引入了一个容易离子化的基团[4]。
• 羧基化合物
虽然含有羧基的化合物可以用负离子条件进行检测，但是某些羧酸类化合物的灵敏度并不能达到检测限要求。这可能与基质效应有关，因为基质效应造成背景噪音很高。
比较而言，APCI比ESI受到基质效应的影响要小。多数羧酸类化合物在衍生化反应后，包括酯化反应，都是用APCI源进行检测。
这些羧酸类化合物通常是脂肪酸，比如酪氨酸类似物和葡糖醛酸衍生物。甲酯化是对此类化合物最常用的衍生化反应。盐酸/甲醇，BF3-甲醇，乙醚重氮甲烷都可以用作甲酯化反应试剂。
例如在LC/MS/MS法测定人血浆中羧甲司坦中[5]，就通过盐酸/甲醇衍生化试剂，不仅提高了灵敏度，而且得到了很好的保留。
• 胺和酰胺类化合物
胺类化合物在建立分析方法的时候，主要困难在于其具有较高的挥发性，较大的极性、碱性以及较强的水溶性。这些性质很容易伴随出现基质效应和高频的背景噪音。
通常对于大分子量的化合物背景噪音一般都比较低，因此我们可以采用衍生化的方法增大待测物的分子量。
用于增强紫外吸收和荧光吸收的衍生化试剂也可以用于伯胺和仲胺的衍生化反应来提高在API离子化方式下的灵敏度。例如7-氟-4-硝基苯噁二唑（NBD-F）用于正ESI检测[6]。
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