大咖说丨破伤风类毒素（TT）质量研究

2023年08月28日

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疫苗是用于预防、治疗人类相应疾病的生物制品。疫苗接种人体后可刺激免疫系统产生特异性的细胞免疫或者体液免疫应答，从而获得相应病原微生物的免疫力。

疫苗可分为减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗（含多肽疫苗）、重组蛋白疫苗、多糖结合疫苗、病毒载体疫苗、核酸疫苗等。

CDE颁布的《预防用疫苗临床前研究技术指导原则》，针对采用传统方法（灭活、减毒、分离提取）制备的预防用疫苗，就工作种子批毒种、纯化工艺阶段、半成品与成品阶段等明确提出质量研究控制的相关要求，质量分析与控制始终是整个研发与生产过程中的重中之重。随着疫苗产业的不断壮大，质量研究也是逐渐深入。

多糖结合疫苗 (glycoconjugate vaccines)是指具有可变结构和数量的多糖单元与非糖单元（蛋白质或短肽、脂类），通过共价连接形成的疫苗，以蛋白质-多糖结合疫苗为主。其中非糖单元作为载体，发挥类似佐剂的作用，激活辅助性 T 细胞继而促进 B 细胞成熟分化形成记忆，从而提供长期免疫保护。

目前用于疫苗的载体蛋白有：白喉毒素的交叉反应物 (cross-reactingmaterial, CRM197)、破伤风类毒素 (tetanus toxoid, TT)、白喉类毒素 (diphtheria toxoid, DT)、脑膜炎耐瑟球菌外膜蛋白复合物 (meningococcalouter membrane protein complex, OMPC) 、流感嗜血杆菌蛋白 D (H. influenzae protein D, HiD) 、铜绿假单胞菌外毒素A (exotoxin A of Pseudomonas aeruginos, EPA)、艰难梭菌毒素 A (Costridium difficile toxin A, CDTA) 和毒素 B (Costridium difficile toxin B, CDTB)的无毒性肽段、肺炎球菌表面蛋白 A (pneumococcalsurface protein A, PspA)、肺炎球菌组氨酸三联蛋白D (pneumococcal histidine triad D, PhtD)、脱毒的链球菌溶素 (detoxified pneumolysin, dPly) 和金黄色葡萄球菌 α-溶素 (Hla)等^[1]。

破伤风类毒素（TT）是由破伤风梭菌产生的一种强效神经毒素蛋白。由破伤风梭菌生产制备的破伤风疫苗自20世纪30年代开始使用，该疫苗经过甲醛脱毒处理的破伤风类毒素（tetanus toxoid，TT）组成。TT蛋白还被广泛用作结合疫苗的载体蛋白，由于破伤风类毒素TT的免疫学特性，独立于T细胞的反应转变为依赖于T细胞的反应，从而增强了针对共轭细菌多糖的免疫原性。

通常情况下，基于结构决定功能的考虑，破伤风类毒素（TT）蛋白可以从一级结构、高级结构、理化性质与生物学活性等方面进行质量研究。

表1 TT蛋白的质量研究列表

1·SEC-HPLC与SDS-PAGE纯度研究

在破伤风类毒素（TT）蛋白的制备过程中，甲醛脱毒处理过程会导致蛋白结合物的产生，脱毒剂与毒素分子，以及培养基中的其他蛋白分子可能会发生不同程度的交联反应，生成分子结构被改变了的单体，或交联形成二聚体或多聚体等。可以通过SDS-PAGE与SEC-HPLC正交的技术分析手段来研究聚体与单体分布与相对含量，破伤风类毒素（TT）典型的纯度图谱如图1-2。另外，还可以根据TT蛋白的SDS-PAGE图谱结果，进一步对降解的条带做降解位点的深入研究。

图1 破伤风类毒素（TT）的SEC-HPLC色谱图^[2]

图2 SDS-PAGE结果图谱

（Mr：蛋白相对分子质量；M：蛋白质 Marker；1-5为不同批次破伤风类毒素样品）^[2]

2· AF4-UV-MALS-RI研究

破伤风类毒素（TT）蛋白与脱毒后的TT蛋白在分布和多分散性方面存在差异。可通过AF4-UV-MALS-RI（不对称流场流分馏(AF4)结合多角度光散射(MALS)和RI检测器）检测分子量分布情况。TT是单分散的（蓝色虚线测多分散性数值 Mw/Mn等于1）。脱毒后的TT蛋白是多分散性（绿色虚线测得的Mw/Mn值等于1.3）。

图3 TT（蓝色）和脱毒后TT蛋白（绿色）的非对称场流分离（AF4）断口图谱^[3]

MALS典型图谱如图4所示，虚线峰表示相对分子量的质量分布，线越水平，产物分子量分布就越单分散，说明产品的均一性好。典型图谱中蓝色虚线显示Mw与TT理论相对分子量是一致的单分散蛋白，而脱毒后的破伤风类毒素TT（绿色）虚线图谱显示为不同蛋白（多分散蛋白）的混合物，表明由于经甲醛脱毒工艺，使得蛋白间之间发生了相互交联，使得TT蛋白以单体、二聚体及多聚体形式存在。

图4 破伤风类毒素TT（蓝色）和脱毒后的破伤风类毒素（绿色）MALS典型图谱（对应于AF4图谱中的Peak2）^[3]

3· 质量肽图与翻译后修饰研究

破伤风类毒素（TT）蛋白经变性、还原、烷基化、Trypsin酶切及LC-MS分析后，可鉴定到TT各肽段的信息，样品原始序列见图5。

图5 破伤风类毒素（TT）理论氨基酸序列^[4]

破伤风类毒素（TT）蛋白的翻译后修饰，除常规的氧化，脱酰胺修饰外，还存在C、H、K、R、Q、W、D等位点上发生甲醇加合物（+30.011Da），K上发生席夫碱加合物（+12.000Da）。文献[3]中所检的破伤风类毒素样品，部分位点发生的修饰列举如下图6所示。

图6 破伤风类毒素（TT）翻译后修饰结果^[3]

4· 氨基酸序列覆盖率研究

破伤风类毒素（TT）理论序列如上图5所示，N端以氨基酸P开始。成熟的破伤风类毒素蛋白会丢失N端氨基酸M，共含1314个氨基酸，可以使用高分辨质谱对TT蛋白的序列进行确认，也可以结合氨基酸组成等技术手段进行蛋白序列的正交确证。

5· 二硫键连接方式研究

依据文献理论序列^[4]，破伤风类毒素理论上含两对二硫键，L-Chain与H-Chain间依靠二硫键（Cys438- Cys466）连接，另一条二硫键为链内二硫键（Cys1076- Cys1092），可以通过高分辨质谱LC-MS/MS的分析研究，对TT蛋白的理论两条二硫键进行确认。

6· 氨基酸组成/消光系数研究

对破伤风类毒素蛋白质样品进行酸水解，形成游离氨基酸，用PITC对游离氨基酸进行衍生化处理，然后使用高效液相色谱对衍生化的氨基酸样品进行分析，可以对TT蛋白的氨基酸组成及消光系数进行分析研究。液相色谱图如图7所示。

图7 破伤风类毒素（TT）液相色谱图

7· 圆二色性研究

一般情况下，蛋白质具有圆二色性，不同二级结构的蛋白质所产生CD谱带的位置、吸收的强弱都不相同。

远紫外扫描图谱主要反映肽键的圆二色性，在蛋白质或多肽的规则二级结构中，肽键是高度有规律排列的，其排列的方向性决定了肽键能级跃迁的分裂情况，可以根据二级结构图谱及软件拟合，估算供试品的二级结构比例。近紫外扫描图谱，反映Trp、Tyr和Phe及二硫键所处微环境的扰动，能应用于研究蛋白质三级结构的精细变化。破伤风类毒素（TT）的远紫外典型图谱如图8所示。

图8 破伤风类毒素（TT）远紫外CD图谱

8· 热稳定性研究

差示扫描微量热法（DSC）是一种可表征蛋白质和其他生物分子热稳定性的检测，热分析法是研究物质受热过程所发生的晶型转变、熔融、蒸发等物理变化或热分解、氧化等化学变化以及伴随发生的温度、能量或重量改变的方法。本实验通过差示扫描量热法（DSC）检测供试品的中间相转变温度（Tm）值和起始变性温度（Tonset）值。Tm是热稳定性的指标，一般情况下，Tm越高，蛋白质越稳定。破伤风类毒素（TT）的Tm值测定典型图谱如图9所示。