技术共探丨关于USP对照品，你了解多少？
2022/06/07
技术共探 | 一文读懂有关支原体检测那些事儿
2021年11月19日
近年来，在生物药品研发与生产中，支原体污染与检测成为热门话题。目前国际上主要国家都有相关法规，规定源于细胞培养的产品都必须确保无支原体污染。因此，解除支原体污染的潜在威胁成为保障生物制品安全性的重要措施之一，这也得到了广大药物研发工作者们的高度重视。
1. 支原体是什么？
支原体（Mycoplasma）是介于细菌和病毒之间，没有细胞壁的原核细胞型微生物。这类微生物最早是在1898年由法国的Nocard及Roux自患牛肺疫的病灶中分离出来的，1967年被正式命名为支原体 。
▲ 支原体形状多样
支原体由胞外结构，单位膜和胞内结构组成。其胞外结构中的荚膜和粘附结构可以帮助支原体粘附至细胞上，更有甚者可以侵入至细胞内。支原体胞内由于缺乏生物合成和代谢能力的基因，属于氨基酸、脂类和某些辅助因子营养缺陷型生物，其所需的物质更多是来源于宿主细胞。
▲ 人成纤维细胞表面支原体的扫描电镜观察
2. 生物制品为什么需要支原体检测？
目前国际上主要国家都有相关法规，规定源于细胞培养的产品都必须确保无支原体污染，这主要是基于以下两方面的原因。
一是，细胞培养中的支原体感染是一个普遍存在的问题。
自1956年Robinson等首次从三株Hela细胞培养中分离出支原体以来，关于支原体污染细胞的报道就屡见不鲜。目前已知的支原体污染中，95%的污染源来自口腔支原体（M. orale），精氨酸支原体（M. arginini），发酵支原体（M. fermentans），猪鼻支原体（M. hyorhinitis）和莱氏无胆甾原体（A.laidlawii）。
▲ 2003-2011年生物制品样本支原体污染情况
▲ 2012-2016年用DNA染色法检测生物制品样本的支原体污染情况
二是，相比于支原体的污染范围，其带来的危害更甚。
细胞是制备疫苗的主要载体之一。支原体通过引起细胞病变，竞争营养和抑制干扰素分泌等机制，产生有毒的代谢产物，从而显著影响生产用细胞的培养及相应生物技术的发挥，干扰病毒复制。这会极大影响疫苗病毒的产量，并诱导机体产生免疫抑制。
同时，在疫苗制造中，常常会将支原体污染带来的干扰误以为是病毒繁殖造成的病变效应，从而导致虚假的效力测定结果，影响病毒真正滴度的测定，使研究结果的真实性和可靠性大大存疑。
因此，针对支原体对细胞培养带来的巨大不良影响，在中国药典、欧洲药典、美国药典和日本药典中都要求，对主细胞库、工作细胞库、病毒种子批以及病毒疫苗等均需执行支原体检查。其中欧洲药典和美国药典更是要求样品首次执行支原体检查或生产流程变更时需要进行干扰性确认，以保证支原体检查结果的有效性。
3. 目前有哪些常见的检测方法？
01. 培养法
通过提供适合支原体生长的营养成分，培养支原体。通过对液体培养基的颜色、浊度变化，固体培养基和半流体培养基的支原体菌落形态来判断支原体的生长。
02. 指示细胞培养法(DNA染色法)
不同于培养法，该方法通过提供适合支原体寄生的指示细胞，供培养支原体。通过对培养物的DNA染色来判断是否存在支原体生长。
03. 核酸扩增技术法
使用PCR或qPCR等核酸扩增技术，对支原体核酸序列中的某个片段进行增量，以此确定样品是否含有支原体DNA来判断是否存在支原体污染。
04. 免疫检测(酶联免疫吸附试验或者免疫荧光试验)
这是建立在支原体特异性抗体基础上的检测法。免疫荧光试验利用支原体的单克隆抗体和荧光标记的二抗识别样品中的支原体抗原，通过荧光显微镜判断是否存在支原体。酶联免疫吸附试验（ELISA）同样也是使用支原体的单克隆抗体，利用抗体上的“标签”蛋白的量来判断是否存在支原体。
05. 生化反应
通过检测精氨酸脱氨酶、核苷磷酸化酶以及6-甲基嘌呤脱氧核酸的毒素，分析是否存在支原体。
4. 哪种检测方法更好？
核酸扩增技术法虽然灵敏度高，但该方法检测的主要目标是支原体的核酸。而支原体核酸的存在并不能代表存在支原体污染（受限于核酸物质的污染以及引物的特异性）。此种检测方法存在一定程度的假阳性可能，因此仅在欧洲药典和日本药典中被采纳，作为一种代替方法。
免疫检测虽然在时效性方面表现亮眼，但灵敏度只能够达到104cfu/mL，而且由于支原体特异性抗体的种类的限制，不能覆盖太多支原体种类，因此这种方法更加适用于临床中对指定的病原性支原体的检测。
生化反应检测由于检测的酶在许多非支原体的微生物中也存在，因此该检查并不完全特异，不适合单独作为生物制药的质控类检测，可以与其它检测方式并用。
培养法和指示细胞培养法则是被药典普遍认可的，用于生物制药的质控类的支原体检测方法。培养法所使用的培养基并不能适用所有的支原体生长，存在一定的局限性，同样指示细胞培养法对于一些胞质吸附能力较弱的支原体检出也会存在一定的局限性。对此，药典中要求对支原体检测需要两种方法共同检测，以确保支原体检出的效力。
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▲ 微谱生物安全实验室实景
针对支原体检查，我们可以提供专业强大，量身定制的支原体检查方案，以适用于不同的样品。
强大的专业性
提供对于不含抗生素的主细胞库，工作细胞库以及病毒种子批的符合中国药典的支原体检查法。同时，还提供对于生产终末细胞和未处理的细胞收获液的更加准确有效的检查。
严谨的合规性
同时符合多国药典的支原体检查方案，一次实验同时适用于多个药典。
广泛的覆盖性
同时符合多国药典的支原体检查方案，一次实验同时适用于多个药典。
专业的针对性
符合欧洲药典的支原体核酸扩增检查法。
定制化的整合研究服务
依据客户样品类型，定制化提供更加精准、有效和快速的支原体检查方案和一体化技术解决方案与策略。
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