多肽类或蛋白质供试品经过酸水解处理,得到游离氨基酸,在弱碱性条件下,用PITC(异硫氰酸苯酯)衍生剂进行柱前衍生,赋予氨基酸以疏水结构和吸收基团,然后使用高效液相在色谱柱上进行分离,并在254nm波长下进行检测。消光系数选取回收率较好的6种氨基酸(Asp,Glu,Ala,Ile,Leu,Lys)进行消光系数E的计算。
多肽类或蛋白质供试品经过酸水解处理,得到游离氨基酸,在弱碱性条件下,用PITC(异硫氰酸苯酯)衍生剂进行柱前衍生,赋予氨基酸以疏水结构和吸收基团,然后使用高效液相在色谱柱上进行分离,并在254nm波长下进行检测。消光系数选取回收率较好的6种氨基酸(Asp,Glu,Ala,Ile,Leu,Lys)进行消光系数E的计算。
蛋白质中未形成二硫键的游离巯基,有可能在蛋白质分子内或分子间氧化错配形成非天然的二硫键,从而可能影响蛋白的稳定性与生物学功能。运用Measure-ITTM巯基检测试剂盒特异性地标记多肽或蛋白质类样品中的游离巯基,之后通过检测荧光信号强度来反映样品中游离巯基的含量,最终通过标准曲线计算样品中游离巯基的相对含量。
Edman降解法是异硫氰酸苯酯(PITC)在弱碱条件下与蛋白质N端氨基偶联生成苯氨基硫甲酰肽(PTC-蛋白质/多肽),然后在无水强酸条件下,N-端的第一个残基从完整的多肽或蛋白链上以2-苯氨基噻唑啉酮(ATZ-AA)的形式裂解下来,之后在稀酸条件下,ATZ-AA转化为更加稳定的苯基乙内酰硫N脲衍生物,即 PTH-氨基酸,生成的PTH-AA输送至高效液相色谱中进行在线分析,剩下的多肽蛋白样品可反复进行上述处理,依次生成各种PTH-AA,经液相色谱柱分离可以确定被测多肽或蛋白质N端的氨基酸排列顺序。
结论:样品的N端序列为NH2-Met-His-Ser-His-Arg-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala,即MHSHRDFQPVLHLVA,且与N端理论氨基酸排列序列一致。
分子排阻色谱技术与多角度激光光散射技术联用(SEC-MALS,Size Exclusion Chromatography with Multi-angle Light Scattering)是将SEC能够有效分析低分子碎片、单体与高分子聚体的含量,联用MALS分析经SEC分离的各分子大小异质体的分子量,以获得各成分的分子量大小信息。